Bioengineering
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Toxiciteitsscreenings in humane retinale organoïden voor farmaceutische ontdekking
Chapters
Summary March 4th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Hier presenteren we een stapsgewijs protocol om volwassen menselijke retinale organoïden te genereren en deze te gebruiken in een fotoreceptortoxiciteitstest om farmaceutische kandidaten te identificeren voor de leeftijdsgebonden retinale degeneratieve ziekte maculaire teleangiëctasieën type 2 (MacTel).
Transcript
Dit protocol biedt een preklinische benadering voor het ontdekken en valideren van farmaceutische behandelingen voor de metabole retinale ziekten direct in menselijk netvliesweefsel. Deze techniek combineert de complexiteit van het metabolisme in menselijke weefsels met de veelzijdigheid en doorvoer van celkweek. We hebben deze test gebruikt om preklinische gegevens te verkrijgen voor de behandeling van de retinale degeneratieve ziekte, MacTel, met behulp van een gemeenschappelijk en veilig lipidenveranderend medicijn, fenofibraat, dat nu in klinische veiligheidsonderzoeken is.
Deze aanpak kan worden toegepast op een aantal veel voorkomende retinale stressoren die leiden tot ziekte, waaronder tekort aan voedingsstoffen, hypoxie, lichttoxiciteit en andere toxische lipiden. Controleer in week 24 van de kweek de organoïden op de vorming van rudimentaire segmenten aan de buitenkant van de organoïde. In week 26 tot en met 28 moeten de buitenste segmenten een dikke laag hebben gevormd.
Wanneer een verdikt twijfelersegment kan worden waargenomen, verdunt u één millimolaire deoxySA-stamoplossing tot 0,51. Eén en twee micromolaire concentraties in drie milliliter retinale differentiatiemedium plus. Selecteer met behulp van een dissectiemicroscoop en een steriele sonde vier groepen organoïden van ongeveer dezelfde grootte en vorm met een minimum van vijf organoïden per groep en splits de groepen in individuele putten van een ultralage aanhechtingsplaat met 6 putten.
Wanneer alle organoïden zijn verzameld, verwijdert u zoveel mogelijk medium uit elk putje en voegt u één concentratie van de deoxySA-oplossing toe aan elk putje. Voeg de voertuigbesturing toe aan de vierde groep organoïden. Vervang na twee dagen kweek de kweeksupernatanten door de juiste verse deoxySA of controleverdunning.
Na vier dagen kweek, sluit cryosectie in en kleurt de organoïden volgens standaardprotocollen om de celdood binnen elke cultuur te kunnen beoordelen. Gebruik na het kleuren een vergroting van vijf tot 10x om een gebied van het gesneden organoïde gedeelte te lokaliseren dat intact, goed gevormd en in een vlak is dat een representatieve doorsnede van de organoïde bemonstert. De sectie moet een duidelijke buitenste nucleaire laag van fotoreceptoren hebben die ten minste een paar cellen dik is, en een afzonderlijke en afzonderlijke laag kernen die geen herstel en kleuring hebben.
Kader de afbeelding in en verhoog de vergroting tot 20x. Kader de dia vervolgens opnieuw in om de afbeelding te vullen met zoveel mogelijk van de fotoreceptorlaag. Stel het Z-vlak in en stel de bovenste ondergrenzen van het Z-bereik in om de volledige diepte van het segment weer te geven.
Maak vervolgens een afbeelding van alle drie de kanalen van fluorofoor in een Z-stack-acquisitie en sla de afbeelding op in een bestandsindeling die de verhouding van het gebied per pixel behoudt. Als u het aantal dode cellen in elk monster wilt kwantificeren, opent u de afbeeldingsstapels in Fiji. Controleer in het venster met importopties van de bio-indeling of er geen vakjes onder de sectie opsplitsing in afzonderlijke vensters zijn aangevinkt en selecteer Afbeelding, Stapels en Z-project om een nieuwe afbeelding voor kwantificering te maken.
Selecteer het afbeeldingskanaal dat het herstel en de kleuring weergeeft en gebruik het gereedschap voor het selecteren van veelhoeken om een continu gebied van fotoreceptoren in de afbeelding te schetsen. Klik op Metingen analyseren en instellen en selecteer het vak Gebied. Klik op Analyseren en meten om het gebied van de fotoreceptoren te meten om de stervende cellen te tellen.
De meting verschijnt in een pop-upvenster. Om de apoptosepositieve kernen in het geselecteerde fotoreceptorgebied te tellen, klikt u met de rechtermuisknop op het puntgereedschap om het meerpuntgereedschap te selecteren en selecteert u de apoptosepositieve kleuring die overlapt met een DAPI-positieve kernen en herstelt en kleurt. Schakel tussen de kanalen om de positieve cellen te valideren.
Deel vervolgens het aantal apoptosepositieve cellen door het gebied om een genormaliseerde waarde voor de celdood binnen de fotoreceptoren per organoïde te verkrijgen. Na het bepalen van de deoxySA-concentratie die de doelceldood induceert, gebruikt u een steriele sonde om drie groepen organoïden van ongeveer dezelfde grootte en vorm te selecteren met een minimum van vijf organoïden per groep. En voeg de groepen toe aan individuele putten van een ultralage bevestiging 6-putplaat.
Voeg de doelceldoodconcentratie van deoxySA, de doelceldoodconcentratie van deoxySA aangevuld met het geneesmiddel van belang of het controlemedium toe aan de juiste put of organoïden. Vervang na twee dagen het supernatant in elk putje door de juiste concentratie van verse behandeling of controlemedium. Beoordeel na vier dagen kweek de culturen op celdood zoals aangetoond.
In deze representatieve analyse werden retinale organoïden gegenereerd uit een niet-maculaire teleangiëctasieën type 2 controle geïnduceerde pluripotente stamcellijn behandeld met vier concentraties deoxySA. Celdood als reactie op deoxySA was concentratieafhankelijk en detecteerbaar in slechts 50 nanomolaire deoxySA. De hoogste geteste concentratie veroorzaakte een robuuste celdood met behoud van de integriteit van de retinale organoïde.
Behandeling met 20 micromolair fenofibraat voorkwam deoxySA-geïnduceerde toxiciteit in de fotoreceptoren van retinale organoïden, waardoor de celdood na vier dagen behandeling aanzienlijk met ongeveer 80% werd verminderd. Vergeet niet om goed gevormde en gezonde organoïden te selecteren om ervoor te zorgen dat de test wordt uitgevoerd in retinale cellen. De organoïden kunnen worden verwerkt voor RNA-verzameling om genexpressie te kwantificeren, waardoor de evaluatie van stresssignalen en de validatie van toxische effecten en reddingen mogelijk is.
Met behulp van deze techniek hebben we het downstream-metabolisme van meerdere verschillende lipiden in organoïden kunnen testen, waardoor de studie van lipidenmetabolisme in menselijke netvliezen is geopend.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
